Η κεντρική εκκλησία του μοναστικού συμπλέγματος, το καθολικό, κτίστηκε νότια του ναού της Παναγίας για να στεγάσει το θαυματουργό λείψανο του οσίου Λουκά. Ανήκει στον αρχιτεκτονικό τύπο του ηπειρωτικού οκταγωνικού και θεωρείται το πρότυπο όλων των μεταγενέστερων ναών αυτού του τύπου. Στους οκταγωνικούς ναούς, που κατ'ουσίαν είναι σταυροειδείς ναοί, μόνο η στήριξη του τρούλου είναι οκταγωνική, ενώ ο κεντρικός χώρος κάτω από αυτόν παραμένει τετράγωνος. Το καθολικό του Οσίου Λουκά χαρακτηρίζεται για τον ευρύ τρούλο του (διαμέτρου 9 μ. περίπου) και αντίστοιχα το διευρυμένο ενιαίο τετράγωνο χώρο κάτω από αυτόν. Το βάρος του τρούλου φέρουν οκτώ ογκώδεις πεσσοί, που γεφυρώνονται σε μεγάλο ύψος, από τέσσερα μεγάλα τόξα ανάμεσα σε τέσσερα ημιχώνια. Από τα παρεκκλήσια, που πλαισιώνουν τον τετράγωνο πυρήνα, ιδιαίτερη σημασία έχει το βορειανατολικό γιατί εκεί, και στο σημείο επικοινωνίας με τη βόρεια κεραία του σταυρού έχει τοποθετηθεί η μαρμάρινη λειψανοθήκη του οσίου. Πρόκειται για το τμήμα του καθολικού που συνδέεται με το ναό της Παναγίας, διευκολύνοντας τη διέλευση των προσκυνητών μπροστά από το ιερό λείψανο και την εισοδό τους στο ναό της Παναγίας. Ταυτόχρονα με το καθολικό κτίσθηκε η κρύπτη, που έχει σε κάτοψη το σχήμα σταυροειδούς τετρακιόνιου ναού. Στην κρύπτη στεγάζεται ο αρχικός τάφος του οσίου Λουκά, που βρίσκεται στο βόρειο τοίχο, ακριβώς κάτω από το χώρο του καθολικού, όπου τοποθετήθηκε η λειψανοθήκη του οσίου. Δύο ακόμα τάφοι στην κρύπτη ανήκουν σε επιφανείς ηγούμενους του μοναστηριού.

Ο επισκέπτης του καθολικού εντυπωσιάζεται από τον πλούσιο εσωτερικό διάκοσμο. Συνθέσεις από χρωματιστά μάρμαρα καλύπτουν το δάπεδο του ναού, όπως και τις κατακόρυφες επιφάνειες των τοίχων. Τα λαμπρά ψηφιδωτά που κοσμούν τις ανώτερες επιφάνειες του καθολικού, αποτελούν ένα από τα σημαντικότερα ψηφιδωτά σύνολα της μεσοβυζαντινής τέχνης. Χρονολογούνται γύρω στη δεύτερη και τρίτη δεκαετία του 11ου αι., είναι δηλαδή πρωιμότερα από τα άλλα δύο μεγάλα ψηφιδωτά σύνολα του ελλαδικού χώρου, αυτά της Νέας Μονής Χίου και του Δαφνίου. Στη κόγχη του ιερού απεικονίζεται η Παναγία ένθρονη βρεφοκρατούσα, ενώ στο χαμηλό θόλο πάνω από το ιερό παριστάνεται η Πεντηκοστή. Στο μεγάλο τόξο επάνω από την είσοδο του ιερού εικονίζονται οι δύο αρχάγγελοι Μιχαήλ και Γαβριήλ. Ο χριστολογικός κύκλος αντιπροσωπεύεται με τέσσερις σκηνές στα ημιχώνια (ο Ευαγγελισμός που δεν σώζεται, η Γέννηση, η Υπαπαντή και η Βάπτιση) και με τέσσερις σκηνές από τον κύκλο του Πάθους (ο Νιπτήρας, η Σταύρωση, η Ανάσταση και η Ψηλάφηση του Θωμά). Στο διακονικό διατηρούνται δύο σκηνές της Παλαιάς Διαθήκης, ο Δανιήλ στο λάκκο των Λεόντων και οι Τρεις Παίδες στην κάμινο. Τη ψηφιδωτή διακόσμηση συμπληρώνουν παραστάσεις ενός ιδιαίτερα μεγάλου αριθμού αγίων, κυρίως μοναχών, ιεραρχών, στρατιωτικών αγίων και αγίων ιατρών.

Τα δύο παρεκκλήσια, βορειοδυτικό και νοτιοδυτικό, μικρό τμήμα του βορειοανατολικού διαμερίσματος και η κρύπτη κοσμούνται με τοιχογραφίες που χροονολογούνται στο τρίτο τέταρτο του 11ου αι.