Βρίσκεται στην ανατολική κλιτύ της Ακροπόλεως. Πρόκειται για το μεγαλύτερο σπήλαιο του λόφου, το οποίο μετά από πολυετείς έρευνες και την ανεύρεση (στις αρχές της δεκαετίας του 1980 από τον αρχαιολόγο της Εν Αθήναις Αρχαιολογικής Εταιρείας Γεώργιο Δοντά) μαρμάρινης στήλης του β΄ μισού του 3ου αι. π.Χ., ταυτίστηκε με το ιερό σπήλαιο της Αγλαύρου. Σύμφωνα με το μύθο, η νύμφη Άγλαυρος, κόρη του βασιλιά των Αθηνών Κέκροπα, έπεσε από τα τείχη της Ακροπόλεως για να σώσει την πόλη από μακρόχρονη πολιορκία, εκπληρώνοντας με αυτόν τον τρόπο χρησμό του μαντείου των Δελφών. Σε αυτό το σπήλαιο έρχονταν οι Αθηναίοι έφηβοι μετά την συμπλήρωση του 18ου έτους της ηλικίας τους, φέροντας πλήρη πολεμική εξάρτυση, για να ορκιστούν πίστη στα ιερά και τα όσια της πόλης, τα οποία θα υπερασπίζονταν στο εξής δίνοντας, αν χρειαζόταν, τη ζωή τους.

Σημειώνεται ότι πριν από την ανασκαφική έρευνα του 1980 το ιερό της Αγλαύρου ετοποθετείτο (λανθασμένα) στο σπήλαιο της Μυκηναϊκής κρήνης.