Το Κάστρο της Λαμίας βρίσκεται στο ψηλότερο τμήμα της πόλης, στην κορυφή ενός βραχώδους λόφου. Δεσπόζει της γύρω περιοχής και ελέγχει την κοιλάδα του Σπερχειού έως το Μαλιακό κόλπο και το πέρασμα που οδηγεί διαμέσου της Όθρυος στη Θεσσαλία. Είναι το σημαντικότερο μνημείο και ο πλέον άμεσος μάρτυρας της ιστορίας της πόλης. Το αρχαιότερο τμήμα του περιβόλου της είναι κτισμένο κατά το πολυγωνικό σύστημα και χρονολογείται στον 5ο αι. π.Χ. Ο χώρος κατοικήθηκε στην περίοδο της Τουρκοκρατίας και στη νοτιοδυτική γωνία κατασκευάστηκε τζαμί. Κατά το Λαμιακό πόλεμο (323/2 π.Χ.), ο στρατηγός των Αθηναίων Λεωσθένης σκοτώθηκε έξω από τα τείχη της πόλης, ενώ πολιορκούσε τους Μακεδόνες που υπερασπίζονταν τη Λαμία. Το 190 π.Χ. ο ύπατος Μάνιος Ακίλος Γλαβρίων κατέλαβε και λεηλάτησε άγρια την πόλη. Την εποχή του Ιουστινιανού η ακρόπολη εντάχθηκε πιθανότατα στο πρόγραμμα επιδιόρθωσης των οχυρών μεταξύ της Θεσσαλίας και των Θερμοπυλών. Το 13ο και 14ο μ.Χ. πέρασε διαδοχικά στα χέρια των ξένων κατακτητών του Μεσαίωνα, κυρίως των Φράγκων και των Καταλανών και ονομάστηκε "Κάστρο". Το 1446 κατελήφθη οριστικά από τους Τούρκους και παρέμεινε στην κατοχή τους έως την απελευθέρωση της Λαμίας το 1833. Την επόχή του Όθωνα κτίστηκε στο κεντρικό πλάτωμα στρατώνας για τις ανάγκες των παραμεθόριων δυνάμεων. Το Κάστρο συνέχισε να χρησιμοποιείται για στρατιωτικούς σκοπούς έως την αρχή του Β΄ Παγκοσμίου Πολέμου. Από το 1994, το Αρχαιολογικό Μουσείο Λαμίας στεγάζεται στον πρώτο όροφο του στρατώνα που επισκευάστηκε γι αυτό τον σκοπό.