Η πόλη ιδρύθηκε το 438/7 π.Χ., η περιοχή όμως είχε κατοικηθεί ήδη από την προϊστορική εποχή.

Αρχαιολογικά ευρήματα από την περιοχή των εκβολών του Στρυμόνα αποδεικνύουν ήδη από την Νεολιθική εποχή την ανθρώπινη παρουσία και στις δύο όχθες του ποταμού και τη συνέχεια της ζωής ως και την εποχή του Χαλκού. Ο πλησιέστερος στην Αμφίπολη νεολιθικός οικισμός εντοπίσθηκε σε γειτονικό στην αρχαία πόλη λόφο, γνωστό ως Λόφο 133, όπου αργότερα αναπτύχθηκε σημαντικός οικισμός στην Πρώιμη εποχή του Σιδήρου, όπως μαρτυρούν τα πλούσια ευρήματα του νεκροταφείου του.

Από τα μέσα του 7ου π.Χ. αιώνα, με την ίδρυση των ελληνικών πόλεων στις εκβολές του Στρυμόνα, αρχίζει η προοδευτική διείσδυση του ελληνικού πολιτισμού στην ενδοχώρα. Οι τάφοι στο νεκροταφείο του οικισμού του Λόφου 133 αλλάζουν μορφή και στα κτερίσματά τους επικρατούν τα πολιτιστικά στοιχεία του ελληνικού κόσμου, ειδώλια, νομίσματα, και προπαντός αγγεία επείσακτα από τις νοτιοελλαδικές πόλεις (Κόρινθο, Αθήνα) και από τις Ιωνικές πόλεις του Βόρειου Αιγαίου.

Η παρουσία του ιωνικού κόσμου είναι εμφανής και στα γλυπτά υστεροαρχαϊκών και πρώιμων κλασικών χρόνων που βρέθηκαν στην περιοχή του Λόφου 133 αλλά και στη θέση της Αρχαίας Αμφιπόλεως. Η τοπική παράδοση επιβιώνει στη μεταλλοτεχνία και προπάντων στα χάλκινα και χρυσά νομίσματα.

Μετά την εγκατάστασή τους στην Ηιόνα, στις εκβολές του Στρυμόνα, το 476 π.Χ., οι Αθηναίοι πραγματοποίησαν και την πρώτη ανεπιτυχή απόπειρα αποικισμού στην περιοχή της Αμφιπόλεως με την βραχύχρονη εγκατάστασή τους στο πόλισμα Εννέα Οδοί, που γρήγορα αφανίστηκε (464 π.Χ.). Παραμένει ακόμα ανοιχτό για την έρευνα πρόβλημα η ταύτιση των Εννέα Οδών με τον οικισμό του Λόφου 133, το στρώμα καταστροφής του οποίου χρονολογείται γύρω στα μέσα του 5ου αιώνα π.Χ. ή με την ίδια την Αμφίπολη, στην περιοχή του βόρειου τείχους της οποίας, οι ανασκαφές έχουν εντοπίσει μια προγενέστερη από το τείχος του 5ου αιώνα εγκατάσταση.

Στην εποχή των Μακεδόνων η Αμφίπολις αναδείχτηκε σε ισχυρή πόλη του Μακεδονικού βασιλείου με εσωτερική αυτονομία και με σημαντική οικονομική και πολιτιστική άνθιση.

Οι ανασκαφές έχουν αποκαλύψει μεγάλο μέρος από τα τείχη και ορισμένα από τα ιερά και τα ιδιωτικά και τα δημόσια κτήρια της πόλης.

Μετά την κατάκτηση της Μακεδονίας από τους Ρωμαίους (168 π.Χ.) η Αμφίπολις ορίζεται πρωτεύουσα της Πρώτης Μερίδος της Μακεδονίας.

Η Ρωμαϊκή Εποχή είναι για την Αμφίπολη περίοδος ακμής μέσα στο πλαίσιο της κοσμοκρατορίας των Ρωμαίων. Σταθμός της Εγνατίας Οδού και πρωτεύουσα μιας πλούσιας ενδοχώρας, η πόλη αναπτύσσεται οικονομικά και πολιτιστικά. Γνωρίζει βέβαια καταστροφές και λεηλασίες αλλά με την υποστήριξη και των Ρωμαίων αυτοκρατόρων, ιδιαίτερα του Αυγούστου και του Αδριανού, παραμένει ένα από τα σημαντικά αστικά κέντρα της Μακεδονίας ως την ύστερη αρχαιότητα. Η ακμή της πόλης αντικατοπτρίζεται στα μνημειακά κτήρια με τα ψηφιδωτά δάπεδα και τις τοιχογραφίες, αλλά και στα αρχαιολογικά ευρήματα που οι ανασκαφές έχουν φέρει στο φως