Το κάστρο της Μυτιλήνης καταλαμβάνει έκταση περίπου 60 στρεμμάτων και αποτελεί ένα από τα μεγαλύτερα κάστρα της Μεσογείου. Η σημερινή μορφή του είναι αποτέλεσμα της οικοδομικής δραστηριότητας των Γατελούζων που κυριάρχησαν στο νησί κατά την περίοδο 1355-1462 και των Οθωμανών που κατέλαβαν τη Λέσβο από το 1462 έως το 1912 ενώ από τη βυζαντινή φάση σώζονται σήμερα μόνο τρία τμήματα: μία βυζαντινή πυλίδα στη βόρεια πλευρά των τειχών, ο ανατολικός τοίχος του κεντρικού οχυρωματικού περιβόλου και η δεξαμενή στο μεσαίο κάστρο.

Η διάταξή του ακολουθεί τη μορφολογία της χερσονήσου. Διαιρείται σε τρία τμήματα: το Άνω, το Μεσαίο και το Κάτω Κάστρο.

Το Άνω Κάστρο είναι προσιτό από την κεντρική διπλή πύλη στη νότια πλευρά του. Στο βορειοανατολικό προμαχώνα της πύλης είναι εντοιχισμένες μαρμάρινες πλάκες με τα εμβλήματα των Γατελούζων και των Παλαιολόγων καθώς και μία τούρκικη επιγραφή. Στα δεξιά της εισόδου υψώνεται ο κεντρικός οχυρωματικός περίβολος. Στο χώρο αυτό βρίσκονται τα σημαντικότερα διοικητικά και θρησκευτικά κτίσματα του κάστρου. Περιλαμβάνει πέντε πύργους που ορίζουν ένα ορθογώνιο αίθριο χώρο και δύο δωμάτια στην ανατολική πλευρά του. Στον κεντρικό δυτικό πύργο υπάρχει αφιερωματική πλάκα με τα οικόσημα των Γατελούζων και των Παλαιολόγων. Στην κατασκευή του χρησιμοποιήθηκε αρχαίο οικοδομικό υλικό προερχόμενο από κτήρια που είχαν παρακμάσει την εποχή αυτή όπως το θέατρο της Μυτιλήνης. Στην εσωτερική αυλή του Περιβόλου διατηρείται από την οθωμανική περίοδο η πυριτιδαποθήκη, στο ισόγειο της οποίας διέμενε η τούρκικη φρουρά. Εξωτερικά του Περιβόλου και σε μικρή απόσταση από αυτόν υπάρχουν τα ερείπια του Κουλέ τζαμί, κτισμένο πάνω σε μια μεγάλη τρίκλιτη βασιλική η οποία πιθανότατα ταυτίζεται με τον ναό του Αγ. Ιωάννη και χρησίμευε ως ταφική εκκλησία των Γατελούζων ηγεμόνων και της οικογένειας τους. Στην παραπάνω υπόθεση συνηγορούν οι ταφές που αποκαλύφθηκαν ανατολικά και δυτικά του ναού και η σαρκοφάγος όπου κατά την παράδοση τάφηκε ο Φραγκίσκος Α΄ και η Μαρία Παλαιολογίνα.

Στα βόρεια του τζαμιού οι ανασκαφές έφεραν στο φως ιερό Δήμητρας και Κόρης που τεκμηριώνει την κατοίκηση της περιοχής κατά την αρχαιότητα. Στον ίδιο χώρο υπάρχουν ενδείξεις και για τη λατρεία της θεάς Κυβέλης.

Στο Μεσαίο Κάστρο η είσοδος γίνεται και μέσω μιας ακόμη πύλης, της Ορτά Καπού. Ο χώρος αυτός περιλαμβάνει πολλά θρησκευτικά και κοσμικά κτήρια της οθωμανικής περιόδου τα οποία διατηρούνται σε καλή κατάσταση. Από τα θρησκευτικά κτήρια ξεχωρίζει ο Τεκές (οθωμανικό μοναστήρι) και ο Μενδρεσές (Οθωμανικό Ιεροδιδασκαλείο) που περιελάμβανε ένα δημόσιο μαγειρείο-πτωχοκομείο (Imaret) στο ισόγειο και δέκα τρουλοσκέπαστα κελιά δερβίσηδων και μια μεγάλη αίθουσα προσευχής και διδασκαλίας στον όροφο. Με την θρησκευτική ζωή των μουσουλμάνων σχετίζεται και το λουτρό που παράλληλα όμως εξυπηρετούσε και τις καθημερινές ανάγκες υγιεινής. Από τα κοσμικά κτήρια ενδιαφέρον παρουσιάζει η Πυριτιδαποθήκη, κατασκευασμένη εξ' ολοκλήρου από πέτρες για την αποφυγή κινδύνου ανάφλεξης και το Στρατιωτικό Νοσοκομείο-Φυλακές. Τέλος τις ανάγκες ύδρευσης εξυπηρετούσαν οι κρήνες και η δεξαμενή χωρητικότητας 400 κυβικών νερού. Η δεξαμενή που καταλαμβάνει τη θέση δημόσιου ρωμαϊκού κτίσματος διακρίνεται για τις πολλές οικοδομικές φάσεις της, μια εκ των οποίων ανάγεται στη βυζαντινή εποχή.

Το Κάτω Κάστρο αποτελεί προσθήκη του 1644 από τον Ιμπραήμ Χαν με σκοπό την προστασία του βόρειου λιμένα και τη σύνδεση του με το κάστρο. Η είσοδος σε αυτό γινόταν από διπλή πύλη στη βόρεια πλευρά, η οποία γκρεμίστηκε το 1960 για να καταστεί δυνατή η διέλευση των οχημάτων. Στο χώρο υπήρχαν περίπου 80 κατοικίες για τις ανάγκες του οθωμανικού στρατού. Σήμερα σώζονται κάποιες από τις οικίες αυτές, ένα λουτρό και μία κρήνη.