Η προσπάθεια για ίδρυση Αρχαιολογικού Μουσείου στα Κύθηρα ξεκινά όταν ο γυμνασιάρχης Σπύρος Στάθης, τη δεκαετία του 1930, και κατόπιν ο φιλόλογος καθηγητής και άμισθος αρχειοφύλακας Θεμιστοκλής Πετρόχειλος, τη δεκαετία του 1940, συγκεντρώνουν αρχαιότητες από παραδόσεις ιδιωτών. Η πρώτη συλλογή στεγάζεται σε αίθουσα του Αρχειοφυλακείου, στο Κάστρο της Χώρας. Αργότερα, το 1959, ο Παναγιώτης Στάθης παραχωρεί μία μικρή αίθουσα στον κεντρικό δρόμο της Χώρας, όπου συγκεντρώνονται αρχαιότητες και κειμήλια διαφόρων εποχών.

Η συστηματική ανασκαφική έρευνα στην Παλαιόπολη τη δεκαετία του 1960 φέρνει στο φως πλήθος αρχαιολογικών ευρημάτων. Την ανάγκη φύλαξης και έκθεσής τους ήρθε να θεραπεύσει η δωρεά, τη δεκαετία του 1970, από τον Κυθηραϊκό Σύνδεσμο του κτηρίου στην είσοδο της Χώρας, όπου τη δεκαετία του 1920 είχε στεγαστεί η Οικοκυρική Σχολή. Το Αρχαιολογικό Μουσείο αρχίζει να λειτουργεί το φθινόπωρο του 1981 και παραμένει επισκέψιμο για 25 χρόνια, μέχρι τον Ιανουάριο του 2006, όταν ένας ισχυρός σεισμός προκαλεί σοβαρές ζημιές στο κτήριο.

Τον Οκτώβριο του 2013 το κτήριο εκκενώνεται και αρχίζουν παράλληλα οι εργασίες επισκευής και επανέκθεσης. Το έργο της «Επισκευής, διαρρύθμισης και επανέκθεσης του Αρχαιολογικού Μουσείου Κυθήρων εντάσσεται στο Επιχειρησιακό Πρόγραμμα «Αττική» του ΕΣΠΑ 2007-2013 στις 8 Αυγούστου 2013 και ολοκληρώνεται στις 31 Δεκεμβρίου 2015. Την μελέτη και επίβλεψη της επισκευής του κτηρίου ανέλαβε η Διεύθυνση Μελετών και Εκτέλεσης Έργων Μουσείων και Πολιτιστικών Κτηρίων και το έργο της επανέκθεσης εκτέλεσε η Εφορεία Αρχαιοτήτων Δυτικής Αττικής, Πειραιώς και Νήσων του ΥΠ.ΠΟ.Α.

Στις 8 Μαΐου 2016 το Μουσείο άνοιξε ξανά τις πόρτες του στο κοινό.